Projekty NCN

Tytuł: Wpływ alfa-1 antytrypsyny na aktywność biologiczną granulocytów obojętnochłonnych: nowe mechanizmy regulacji przewlekłego stanu zapalnego w układzie oddechowym.
Numer: (2015/17/B/NZ5/01370) – OPUS 9
Okres realizacji: 23.03.2016 – 22.03.2022 r.
Kwota finansowania: 1 202 325,00 zł
Opis: Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) jest poważnym problemem społecznym i ekonomicznym, dotyka 10-15% populacji dorosłych powyżej 40 roku życia i jest związana z wysoką śmiertelnością. Szacuje się, że do roku 2020 POChP stanie się 4. główną przyczyną zgonów na świecie. Procesy odpowiedzialne za rozwój zmian w układzie oddechowym nie zostały dostatecznie dobrze poznane, co skutkuje brakiem terapii skutecznie zapobiegających postępowi choroby. Wiadomo, że główną populacją komórkową napływająca do płuc i odpowiedzialną za destrukcję ich tkanek w przebiegu POChP są granulocyty obojętnochłonne (neutrofile). Nadal jednak dysponujemy niewielką liczbą szczegółowych badań nad profilem aktywności tych komórek na różnych etapach choroby. Zachwianie równowagi proteazowo-antyproteazowej, między innymi na skutek wzmożonej produkcji proteaz przez neutrofile jest jednym z zaburzeń kluczowych dla POChP. Jego znaczenie potwierdzają obserwacje u chorych dotkniętych ciężkim wrodzonym (PiZZ) niedoborem alfa-1 antytrypsyny (AAT), która z kolei jest najważniejszym elementem obronnego mechanizmu antyproteazowego. W efekcie wrodzony niedobór AAT jest jedynym genetycznie uwarunkowanym czynnikiem ryzyka POChP, może skutkować rozwojem choroby nawet u osób bez innych narażeń, w tym niepalących. Badania opublikowane w ostatnich latach przez nas, jak również innych autorów dowodzą, że alfa-1 antytrypsyna ma też inne istotne ochronne działania przeciwzapalne i immunomodulacyjne, które w istotny sposób podlegają osłabieniu u palących oraz chorych na POChP. Jesteśmy przekonani, że szczegółowa charakterystyka różnych typów aktywności neutrofilów (NEU), zwłaszcza tych powiązanych z oddziaływaniem z aktywną biologicznie AAT może stanowić nowy etap poznania mechanizmów i dróg sygnałowych regulujących ich aktywność u zdrowych i chorych na POChP. Nasze badania dają w ten sposób nadzieję na opracowanie efektywnych, celowanych terapii dla chorych na POChP.

Tytuł: Wpływ C-terminalnego peptydu alfa1-antytrypsyny na rozwój powikłań płucnych u nosicieli PiZZ (ciężki niedobór alfa1-antytrypsyny) – analiza aktywności biologicznej peptydu wobec granulocytów obojętnochłonnych.
Numer: 2018/29/B/NZ5/02346 – OPUS 15
Okres realizacji: 28.01.2019 – 27.01.2024 r.
Kwota finansowania: 1 529 014,00 zł

Opis: Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), czwarta przyczyna śmiertelności i umieralności na świecie charakteryzuje się przewlekłą, utrwaloną i postępującą obturacją dróg oddechowych. POChP jest chorobą wysoce heterogenną klinicznie, w jej patomechanizmie ważną rolę odgrywają czynniki genetyczne i środowiskowe oraz ich wzajemne interakcje. W efekcie obserwowane są istotne różnice w charakterze i przebiegu klinicznym choroby, również u pacjentów z podobnym stopniem uszkodzenia płuc ocenianym za pomocą ograniczenia przepływu powietrza w oskrzelach.
U części chorych rozwój POChP jest uwarunkowany genetycznie, aberracjami w genie SERPINA1 kodującym białko alfa-1 antytrypsynę (AAT). Najczęstszą defektywną postacią genu jest wariant Z, który różni od prawidłowego substytucją Glu342 na Lys. Ciężka homozygotyczna postać niedoboru AAT uwarunkowana genotypem PiZZ, wiąże się z wysokim ryzykiem wczesnej rozedmy płuc, zwłaszcza u palaczy. AAT jest jednym z kluczowych białek ostrej fazy w ludzkim krwioobiegu i głównym inhibitorem elastazy neutrofilowej, odgrywa więc podstawową, wiodącą rolę w ochronie płuc przez niszczącym działaniem proteaz. Z powodu braku tej osłony homozygotyczni nosiciele PiZZ pozbawieni aktywnego biologicznie białka AAT w krwiobiegu i tkankach obwodowych, są w szczególnie narażeni na ryzyko rozwoju rozedmy płuc. Jednak również w tej grupie obserwowana jest znacząca heterogenność pod względem obecności i nasilenia dolegliwości, czasu od wystąpienia pierwszych objawów do rozpoznania, a także odpowiedzi na zastosowane leczenie. Część nosicieli pozostaje bezobjawowa przez całe życie. To znaczące zróżnicowanie fenotypowe w istotny sposób utrudnia diagnostykę i opiekę medyczną nad nosicielami PiZZ. Identyfikacja biomarkera, czy też „sygnatury” biologicznej, różnicującej nosicieli PiZZ o różnym rokowaniu umożliwiłaby lepsze zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za rozwój choroby płuc, a w związku z tym jej skuteczniejsze leczenie. W niniejszym projekcie weryfikujemy hipotezę, że różnice w osobniczym ryzyku choroby płuc w populacji nosicieli PiZZ są związane z działaniem różnych molekularnych form białka AAT i ich zróżnicowanej aktywności regulacyjnej wobec granulocytów obojętnochłonnych. Postulujemy, że polimery Z AAT (obecne bez wyjątku u wszystkich nosicieli wariantu PiZ) tworząc kompleks z krótkimi hydrofobowymi fragmentami AAT (powstającymi podczas cięcia białka AAT lub syntezowanych de novo) – peptydem C-terminalnym, stanowią silny prozapalny bodziec dla neutrofilów krwi obwodowej i pośrednio procesu destrukcji tkanki oddechowej, co w dłuższej perspektywie prowadzi do rozwoju choroby płuc. Uważamy więc, że fragmenty białka AAT stanowią istotny czynnik promujący szkodliwe działanie polimerów białka Z, aktywację neutrofilów i rozwój narządowych powikłań AATD w zakresie układu oddechowego.

Tytuł: Czynniki Mycobacterium tuberculosis wpływajace na częstość transmisji gruźlicy
Numer: 2019/35/B/NZ7/00942 – OPUS 18
Okres realizacji: 09.07.2020 – 08.07.2024 r.
Kwota finansowania: 2 424 060,00 zł

Opis: Epidemia to występowanie w określonym czasie i w określonym miejscu zwiększonej niż oczekiwana ilości przypadków zachorowań. Epidemie towarzyszą ludzkości od zarania dziejów i niosą ze sobą bardzo poważne skutki. Szacuje się, że jedna z najpoważniejszych historycznych epidemii w historii ludzkości, Czarna Śmierć wywołana przez bakterię Yersinia pestis, spowodowała śmierć około 60% populacji Europy. Jest wiele czynników wpływających na rozwój epidemii chorób zakaźnych. Sprzyja im skupienie ludzi na małym obszarze, brak odpowiedniej higieny czy wentylacji pomieszczeń. Dla rozwoju choroby istotny jest stan immunologiczny pacjenta- dzieci, osoby starsze czy przewlekle chore są z reguły bardziej podatne za zakażenie. Co istotne, czynniki warunkujące częstszą transmisję choroby mogą znajdować się w obrębie samego patogenu. Identyfikacja takich czynników umożliwia szybką interwencję służb medycznych w przypadku zdiagnozowania zakażenia szczególnie groźnym wariantem patogenu. Identyfikacja czynników wpływających na transmisyjność patogenu jest zatem ważna dla skutecznego powstrzymywania rozprzestrzeniania się epidemii. Jedną z najpoważniejszych chorób bakteryjnych współczesnego świata jest gruźlica, wywoływana przez prątki gruźlicy, Mycobacterium tuberculosis. Prątki gruźlicy są szczególnymi bakteriami, u których nie stwierdzono horyzontalnego transferu genów. Zatem cała zmienność genetyczna i fenotypowa tych bakterii warunkowana jest przez duplikacje, delecje, a przede wszystkim przez polimorfizmy pojedynczych nukleotydów. Ich zmienność warunkowana jest zatem przez stosunkowo subtelne zmiany w genomach, a nie, jak zdarza się to u innych gatunków bakterii, poprzez nabywanie nowych genów warunkujących wirulencję. Nie jest zatem jasnym, czy istnieją czynniki prątków gruźlicy, które wpływają na transmisję choroby, czy transmisja tej choroby ma związek wyłącznie ze stanem gospodarza i warunkami środowiska.
Nasza hipoteza badawcza zakłada, że istnieją czynniki zwiększające częstość transmisji gruźlicy, które znajdują się wewnątrz prątków gruźlicy. W naszych badaniach wykorzystamy kolekcję szczepów prątków gruźlicy zgromadzoną w Instytucie Gruźlicy i Chorób Płuc. Nasz Instytut jest Laboratorium Referencyjnym do spraw gruźlicy w Polsce. Z kolekcji wybierzemy po 250 szczepów, które zostaną przyporządkowane do grupy „wysoce transmisyjnej” lub „nisko transmisyjnej”. Chcemy zbadać, czy istnieją cechy, którymi różnią się obie grupy. Badania te prowadzone będą na poziomie występowania charakterystycznych cech fenotypowych prątków, charakterystycznej odpowiedzi gospodarza wobec prątków oraz na poziomie zmienności w DNA prątków. Uzyskane wyniki weryfikowane będą w warunkach eksperymentalnych, z wykorzystaniem prątków gruźlicy modyfikowanych genetycznie. Badania prowadzone będą we współpracy z Instytutem Biologii Medycznej PAN w Łodzi oraz z Laboratorium Biobank Uniwersytetu Łódzkiego. Instytuty te posiadają wieloletnie doświadczenie odpowiednio w generowaniu ukierunkowanych mutantów M. tuberculosis oraz w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu DNA. Oczekujemy, że wyniki naszych badań pozwolą na identyfikację nowych czynników sprzyjających transmisji gruźlicy i tym samym pozwolą na skuteczniejszą kontrolę tej groźnej choroby na świecie.

Tytuł: Wykorzystanie wzorców ewolucyjnych w optymalizacji chemioterapii gruźlicy.
Numer: 2019/34/E/NZ6/00221 – SONATA BIS 9
Okres realizacji: 10.01.2020 – 30.09.2025 r.
Kwota finansowania: 3 172 960,00 zł

Opis: Antybiotyki to związki chemiczne stosowane w leczeniu infekcji bakteryjnych. Odkrycie antybiotyków przez Aleksandra Fleminga zrewolucjonizowało medycynę i ocaliło miliony ludzkich żyć. W dzisiejszym świecie nie wyobrażamy już sobie świata bez antybiotyków. Na przestrzeni lat były one powszechnie administrowane zarówno ludziom jak i zwierzętom. Z biegiem lat okazało się, że to powszechne stosowanie antybiotyków ma także swoją ciemną stronę. Zorientowano się, że bakterie są w stanie wytwarzać formy oporne na działanie antybiotyków. Czynnikami sprzyjającymi pojawianiu się form lekoopornych są źle dobrane dawki antybiotyków czy przedwczesne zakończenie terapii. Dlatego też skuteczność stosowanych obecnie antybiotyków spada i koniecznym jest poszukiwanie nowych związków przeciwbakteryjnych. Jednym z najgroźniejszych patogenów bakteryjnych współczesnego świata są prątki gruźlicy. Światowa Organizacja Zdrowia szacuje, że z powodu gruźlicy umiera co roku 1,5 mln ludzi. Liczba osób zakażona prątkami lekoopornymi szacowana jest na 600 000. Niestety, w 2015 tylko 52% ludzi zakażonych prątkami lekoopornymi udało się wyleczyć. Celem niniejszego projektu jest ocena skuteczności nowatorskiej metody optymalizacji terapii przeciwbakteryjnej opartej o charakterystyczne wzory ewolucyjne obecne w DNA bakterii. Badania zostaną przeprowadzone na modelu prątków gruźlicy, w odniesieniu do trzech białek stanowiących tarczę molekularną dla obecnie stosowanych leków przeciwprątkowych. Stawiamy hipotezę, że identyfikacja charakterystycznych wzorców ewolucyjnych może:
1) ułatwić identyfikację mutacji w DNA prowadzących do oporności na leki;
2) ułatwić identyfikację skutecznych związków przeciwbakteryjnych.
Projekt podzielony został na cztery etapy. W pierwszym etapie porównamy ze sobą tysiące bakterii i zidentyfikujemy wzorce ewolucyjne, sugerujące które fragmenty białek odpowiedzialne są za powstawanie lekooporności oraz które fragmenty białek są kluczowe dla jego funkcjonowania. W drugim etapie projektu, w wyniki modyfikacji genetycznych, uzyskamy prątki gruźlicy u których zostaną zmodyfikowane regiony białek zidentyfikowane w pierwszym etapie projektu. Etap ten ma na celu eksperymentalne potwierdzenie, że zidentyfikowane przez nas regiony białek faktycznie wpływają na funkcjonowanie bakterii. W trzecim etapie projektu wykorzystamy komputerowe metody obliczeniowe, aby zidentyfikować związki chemiczne łączące się do białek. Nowo zidentyfikowane związki miałby być aktywne przeciwko wariantom białek warunkującym lekooporność lub wiązać się do szczególnie zachowanych ewolucyjnie fragmentów białek. W ostatnim etapie projektu przetestujemy skuteczność związków zidentyfikowanych metodami komputerowymi przeciwko prątkom gruźlicy w warunkach laboratoryjnych. Uzyskane w toku tego projektu dane mogą umożliwić optymalizację terapii przeciwgruźliczej. Jeżeli oceniania tutaj metoda optymalizacji terapii przeciwbakteryjnej okaże się skuteczna, będzie ją można zastosować do innych patogenów bakteryjnych. Co więcej, uzyskane w toku niniejszego projektu dane będą mogły zostać wykorzystane w warunkach klinicznych, przy identyfikacji zakażeń lekoopornych, oraz do usprawnienia komputerowych metod obliczeniowych dotyczących oddziaływań molekularnych. Być może uda nam się zidentyfikować nowe, skuteczne związki przeciwgruźlicze.

Tytuł: Poszukiwanie genetycznych markerów lekooporności wśród mono- i wielolekoopornych szczepów Mycobacterium tuberculosis.
Numer: 021/05/X/NZ6/00165 – MINIATURA 5
Okres realizacji: 01.10.2021 – 30.09.2022 r.
Kwota finansowania: 48 439,00 zł
Opis: Gruźlica (TB), wywołana przez prątki Mycobacterium tuberculosis, jest jedną z chorób zakaźnych, która poważnie zagraża zdrowiu publicznemu. Spośród wszystkich chorób infekcyjnych gruźlica odnotowuje najwyższą śmiertelność na świecie, przewyższającą HIV/AIDS. W 2019 roku, Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zarejestrowała około 10 mln nowych zachorowań na gruźlicę oraz prawie 1.5 milionów zgonów (1). Jednym z głównych czynników wpływających na aktualną sytuację epidemiologiczną TB jest narastające zjawisko lekooporności prątków. Pojawienie się szczepów mono-lekoopornych i progresja ich lekooporności wpływa na leczenie gruźlicy, które staje się coraz trudniejsze i bardziej wymagające. Według Krajowego Rejestru Zachorowań na Gruźlicę raportującego stan sytuacji epidemiologicznej gruźlicy w Polsce, co roku wykrywanych jest ponad 100 chorych z opornością na co najmniej jeden lek przeciwprątkowy. Niepokojący jest również fakt, że z roku na rok wśród chorych z gruźlicą lekooporną obserwuje się coraz wyższy odsetek postaci wielolekoopornej, w tym gruźlicy typu MDR (multidrug resistance) z opornością na co najmniej dwa kluczowe leki stosowane w terapii gruźlicy – izoniazyd i rifampicynę oraz oporne niemal na wszystkie leki przeciwprątkowe (XDR – extensive drug resistance i TDR – total drug resistance) (2). Obecnie w wielu ośrodkach na świecie szeroko prowadzone są badania dotyczące poszukiwania molekularnych podstaw lekooporności prątków gruźlicy, a wyniki tych badań mają istotne znaczenie w dobrze odpowiedniego leczenia. Główną rolę w kształtowaniu oporności na leki przeciwprątkowe odgrywają spontaniczne mutacje w genach kodujących białka lub RNA będące często celami molekularnymi leków. Mutacje mają zwykle charakter punktowy lub niewielkich (kilku nukleotydowych) insercji czy delecji (3,4). Wśród szczepów M. tuberculosis mutacje występują z różną częstością i w różny sposób kształtują fenotyp lekooporności, co wyraża się odmiennym mianem oporności szczepu na dany lek przeciwprątkowy. Na przykład wysoki poziom oporności na rifampicynę prątków gruźlicy skorelowany jest z mutacjami w kodonach 526 oraz 531 genu rpoB, a niski z mutacjami w kodonach 511, 516, 518 i 522 (5). Celem zaplanowanych badań będzie określenie molekularnych determinantów oporności na leki przeciwprątkowe wśród mono- i wielolekoopornych szczepów M. tuberculosis. Uzyskane wyniki pozwolą jednocześnie określić poziom lekooporności badanego szczepu. Badania wielu autorów wykazują, że znajomość poziomu lekooporności wyizolowanego szczepu M. tuberculosis, szczególnie w przypadku szczepów z niskim bądź średnim mianem oporności na dany lek, może przyczynić się do całkowitego wyleczenia chorego. Znajomość miana oporności ma istotne znaczenie w trudnych przypadkach leczenia gruźlicy lekoopornej, a wiedza ta zwiększa prawdopodobieństwo wyleczenia chorego. Należy zaznaczyć, że ostatni z głównych leków przeciwprątkowych tj. rifampicyna został wprowadzony do terapii w latach 60-tych XX wieku i do chwili obecnej nie pojawił się nowy lek tzw. pierwszego wyboru. W związku z tą sytuacją określenie poziomu lekooporności dla leków głównych ma istotne znaczenie w terapii gruźlicy. W badaniach zostanie wykorzystana kolekcja szczepów prątków gruźlicy zgromadzona w Zakładzie Mikrobiologii, Instytutu Gruźlicy i Chorób Płuc. Z kolekcji zostanie wybranych 80 szczepów M. tuberculosis wyizolowanych w latach 2019-2020 od chorych na gruźlicę lekooporną. Szczepy zostaną poddane analizie molekularnej z zastosowaniem metody sekwencjonowania genów warunkujących oporność na dany lek. Poznanie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw oporności na leki pozwoli zrozumieć genetykę i patofizjologię choroby. Wyniki uzyskane w ramach projektu pozwolą na określenie molekularnych mechanizmów tolerancji Mycobacterium na leki oraz ich wpływu na rozwój gruźlicy wielolekoopornej z niskim i wysokim mianem oporności na leki przeciwprątkowe.

Tytuł: Profilowanie ekspresji pozakomórkowych mikroRNA u chorych na EGFR-dodatniego niedrobnokomórkowego raka płuca z nabytą opornością na inhibitory kinazy tyrozynowej EGFR: badania pilotażowe.
Numer: MINIATURA 5
Okres realizacji: 02.11.2021 – 02.05.2023 r.
Kwota finansowania: 49 950,00 zł
Opis: Głównym celem projektu jest ocena zasadności wyboru i skuteczności metody NanoString (nCounter Analysis System) w profilowaniu ekspresji pozakomórkowych miRNA w osoczu krwi oraz wstępna weryfikacja na poziomie ex vivo hipotezy, że ekspresja pewnych miRNA jest istotnie powiązana z nabytą opornością NDRP typu gruczołowego na IKT EGFR. Hipotezę oparto na wynikach własnych badań in vitro przeprowadzonych na sześciu liniach komórkowych NDRP typu gruczołowego. Planowane działanie naukowe, tzn. badania pilotażowe w zakresie profilowania ekspresji pozakomórkowych mikroRNA (miRNA) u chorych na EGFR-dodatniego niedrobnokomórkowego raka płuca (NDRP) z nabytą opornością na inhibitory kinazy tyrozynowej (IKT) receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), mają przede wszystkim na celu sprawdzenie poprawności założonej procedury badawczej opartej na izolacji pozakomórkowych miRNA z osocza chorych na NDRP i wysokoprzepustowej analizie ich ekspresji w badanym materiale metodą NanoString. Planowane działanie naukowe jest niezbędne do kontynuacji badań nad rolą i przydatnością kliniczną miRNA w zjawisku nabytej oporności NDRP na leczenie IKT EGFR, które rozpoczęto w 2016 roku w ramach grantu Naukowej Fundacji Polpharmy (projekt „Profilowanie ekspresji mikroRNA jako potencjalnych markerów wrażliwości/oporności komórek niedrobnokomórkowego raka płuca in vitro na odwracalne i nieodwracalne inhibitory kinazy tyrozynowej EGFR z zastosowaniem sekwencjonowania następnej generacji”, nr 2015/05/10, kierownik: Dr Adam Szpechciński), które prowadzono wyłącznie w oparciu o model komórkowy in vitro (bez wykorzystania materiału klinicznego od chorych). Weryfikacja poprawności skonstruowania planu badawczego oraz założonej metodologii jest niezbędna z uwagi na koszto- i pracochłonność zaplanowanych doświadczeń, w szczególności analizy ekspresji miRNA metodą NanoString. Pomyślna realizacja planowanego działania naukowego pozwoli przyjąć, że przeprowadzenie właściwych badań na materiale klinicznym od licznej grupy chorych (planowana jest kohorta testowa oraz kohorta walidacyjna o liczebności co najmniej 20 osób każda oraz pomiar ekspresji miRNA dla przynajmniej 6 punktów czasowych) ma duże szanse powodzenia. Planowane działanie naukowe umożliwi również wstępną weryfikację przyjętej hipotezy, że ekspresja pewnych miRNA jest istotnie powiązana z nabytą opornością NDRP typu gruczołowego na IKT EGFR i może być przydatna diagnostycznie i klinicznie, którą wysunięto na podstawie doświadczeń in vitro.